实验目的
1. 学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能用限制性核酸内切酶对载
体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。 2. 学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。
3. 学习利用T4 DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA分子的技
术，了解并掌握几种常用的连接方式。 4. 掌握利用Cacl2 制备感受态细胞的方法。 5. 学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。
6. 学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。
7. 学习并掌握使用Omaga试剂盒抽提质粒的方法及进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA片段。
实验原理：
（一）限制性核酸内切酶的酶切反应
体外构建重组DNA分子，首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能在目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源供体DNA时不能得到完整的目的基因。其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。单酶切法简单易行，但是后期筛选工作比较复杂。各种限制性内切酶都有其最佳反应条件，最主要的因素是反应温度和缓冲液的组成。在双酶切体系中，如果两种酶对盐离子的浓度和温度要求一致，原则上可以将这两种酶同时加入一个反应体系中同步酶切；如果不一致，则酶切反应最好分步进行，常用的酶切顺序是：先低盐后高盐，先低温后高温。
酶切与连接是两个密切相关的步骤，要达到高效率的连接，必须酶切完全，酶切的DNA数量要适当。另外，酶切反应的规模也取决于需要酶切的DNA的量，以及相应的所需酶的量。一般的，酶切0.2~1.0µg的DNA分子时，反应体积约为15~20µg，DNA的量越大，反应体积可按比例适当放大。酶的用量参照标准：一个标准单位酶能在指定的缓冲液系统和温度下，1h完全酶解1µg的pBR322 DNA分子。如果酶活力低，可以适当增加酶的用量，但是最高不能超过反应总体积的10%。因为限制性核酸内切酶一般是保存在50%甘油的缓冲液中，如果酶切反应体系中甘油的含量超过5%，就会抑制酶的活性。
（二）载体与外源DNA的连接反应
连接反应总是紧跟酶切反应，外源DNA片段与载体分子连接的方法即DNA分子体外重组技术主要依赖限制性核酸内切酶和DNA连接酶催化完成的。DNA连接酶催化两双链DNA片段相
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邻的5’-磷酸和3’-OH间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自T4噬菌体的T4 DNA连接酶，它可以连接黏性末端和平末端。连接反应时，载体DNA和外源DNA的摩尔数之比控制在1:（1~3）之间，可以有效地解决DNA多拷贝插入的现象。实际操作中，反应温度介于酶作用速率和末端结合速率之间，一般是16℃，平末端适当提高连接反应温度。反应时间与温度有关，随温度的提高，反应速度增加，所需时间会相应减少，16℃下最常用的连接时间为12-16h。
（三）感受态细胞的制备及质粒转化
构建好的重组DNA转入感受态细胞中进行表达的现象就是转化。能进行转化的受体细胞必须是感受态细胞，即受体细胞最容易接受外源DNA片段实现转化的生理状态，它决定于受体菌的遗传特性，同时与菌龄、外界环境等因素有关。人工转化是通过人为诱导的方法使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内，该过程与细菌自身的遗传控制无关，常用热击法，电穿孔法等。能否实现质粒DNA的转化还与受体细胞的遗传特性有关，所用的受体细胞一般是限制修饰系统的缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2法，制备好的感受态细胞可以加入终浓度为15%的无菌甘油，-70℃可保存半年至一年。经过CaCl2处理的细胞细胞膜通透性增加，允许外源DNA分子进入。在低温下，将携带有外源DNA片段的载体与感受态细胞混合，经过热击或电穿孔技术，使载体分子进入细胞。进入受体细胞的外源DNA分子通过复制、表达，使受体细胞出现新的遗传性状。将这些转化后的细胞在选择性培养基上培养，即可筛选出重组子。本实验以E.coli- DH 5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理，使其处于感受态，然后将重组后的pUC19质粒在42℃下热击90s，实现转化。
（四）重组子的鉴定与外源基因的表达
重组DNA进入宿主细胞后，必须使用各种筛选与鉴定手段区分转化子（接纳载体或重组DNA分子的转化细胞）与非转化子（未接纳载体或重组DNA分子的转化细胞）。而转化子又分为含有重组DNA的转化子（重组子）和仅含有空载体分子的转化子（非重组子）。重组子含有的重组DNA分子中有期望重组子（含有目的基因的重组子）和非期望重组子（不含有目的基因的重组子）。本实验中采用的方法是平板筛选法（α互补筛选原理）、电泳筛选法进行初步鉴定，进一步将采用PCR检测以及酶切验证进行较为准确的鉴定。
利用抗药性筛选原理可筛选出转化子。质粒pUC19携带有氨苄青霉素抗性基因（Ampr）,在含有氨苄青霉素平板上筛选转化子，没有导入质粒pUC19的受体细胞，在含有氨苄青霉素的平板上不生长。
利用α互补筛选原理可筛选出转化子中的重组子与非重组子。α互补筛选原理是根据菌落颜色筛选含有重组质粒的转化子。据菌落颜色筛选含有重组质粒的转化子，利用β-半乳糖苷酶筛选
系统来选择。载体上带有一个来自大肠杆菌的lac操纵子的DNA区段，这一区段编码β-半乳糖苷酶氨基端的一个蛋白片段。IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)可以诱导该片段的合成，而该片段能与宿主细胞所编码的β-半乳糖苷酶羧基端的一个蛋白片段互补(α互补)。故暴露于诱导物IPTG的细菌含有编码lac Z基因的质粒可同时合成该酶的两种片段，该菌在麦康凯培养基上利用乳糖产酸生成红色菌落。在外源DNA插人质粒的多克隆位点后，使编码β-半乳糖苷酶氨基端片段的基因失去作用，从而破坏了α互补作用，使重组子菌落显白色。利用这种筛选方法可方便地将含目的基因的重组子筛选出来。
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实验材料
1. 菌株： E.coli DH 5α
2. 培养基： LB培养基、麦康凯培养基 3. 试剂材料：
酶切反应：（DNA pUC19 质粒，酶切10×buffer，Hind Ⅲ,重蒸水，λ DNA。）
连接反应：（酶切后的DNA（pUC19 质粒和λ DNA），连接10×buffer，T4 连接酶，重蒸水。） 感受态细胞的制备：（0.1M CaCl2 ）
转化：（连接液和感受态细胞，0.1M CaCl2，冰块。）
琼脂糖电泳：琼脂糖，TAE缓冲液（50×），上样缓冲液（10×），溴化乙锭（EB）染液。
4. 仪器器材：
恒温振荡培养箱，高速冷冻离心机，漩涡振荡器，恒温水浴锅，Eppendorf管，微量移液器，培养皿，三角瓶，酒精灯，量筒，接种环，涂布器，电子天平，微波炉，电泳仪，制胶槽，电泳槽，凝胶成像检测仪，琼脂糖凝胶梳子，手套。
实验步骤
（一）载体与外源片段限制性酶切反应
1.在1.5ml的Eppendorf管中依次加入酶切反应的各种成分：
表1 pUC19质粒及λDNA酶切反应体系
试剂（用量单位：µl）
重蒸水 10×buffer
DNA
pUC19(载体)
13.0 2.0 3.5 1.5 20.0
λDNA（目的基因）
66.0 10.0 15.0 9.0 100.0
pUC19（商品）
37.5 5.0 5.0 2.5 50.0
HindⅢ(1.5U/µl)
总计
体系混匀后，1000rpm离心1min，37℃水浴2小时
2.电泳检测：10.0µl样品+2.0µl loading buffer ，琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果。
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（二）载体与外源片段连接反应
1.在1.5ml的Eppendorf管中依次加入连接反应的各种成分：
表2 连接反应体系
编号 1 2 3 4 5 总计
试剂 ddH2O
10×Ligase Buffer pUC19DNA/HindⅢ λDNA/HindⅢ T4-DNA连接酶 连接体系
适当离心，16℃水浴12-16小时
备注
（三）感受态细胞的制备
1. 甘油管E.coli DH5α（APS)→接LB平板（过夜）→37℃，12-16小时→接单菌落于LB平板→
37℃，过夜→划线于AP平板→37℃，过夜→不生长。 2. LB平板上挑单菌落至20ml LB培养基→37℃ 250rpm 过夜→取1%转至新20ml LB培养基→
37℃ 180rpm 2-3小时→冰浴10min→收集菌体于两EP管→菌体离心4000rpm 5min→弃上清→再次补加菌液→离心4000rpm 5min→弃上清→涡旋细胞
3. 加800µlCaCl2 (0.1M)→颠倒混匀→4000rpm离心5min→弃上清→加100µlCaCl2 轻悬细胞（慢
慢敲打）→冰浴20min→最终得到2管100µl感受态细胞
（四）质粒转化
1. 将上述制备好的感受态细胞分为三管，分别为50µl,50µl,100µl，对三管分别进行一下处理：
受体菌对照组：50µl感受态细胞
pUC质粒对照组：50µl感受态细胞 + pUC19质粒DNA 1.0µl 重组质粒转化组：100µl感受态细胞 + 重组质粒5.0µl
2. 用枪尖缓慢吹打混匀，三管均于冰上放置10min，在42℃水浴中热击90s，然后迅速置于冰上，
质粒已经吸附到感受态细胞的表面，此时不能剧烈振荡，以增加转化效率；
3.向上述3管中分别加入450µl(50µl管）和900µl（100µl管）新鲜的LB培养基，混匀后，37℃摇床培养1h，使受体菌恢复正常生长状态。
（五）稀释和涂布平板及重组质粒的初步筛选（AP抗性筛选与α互补筛选法）
1.无菌操作，将转化细胞溶液按以下操作涂布平板：
+
体积/µl 3.2 1.0 1.2（1.0-1.5） 3.8（3.5-4.4）
0.8 10.0
pUC19/HindⅢ先60℃水浴10min，打开自连接，也可使酶 HindⅢ失活，然后冰浴，再配置连接体系
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⑴受体菌对照组：取50µl受体菌液分别涂布AP和AP的麦康凯培养基，各1个。 ⑵pUC19质粒对照组：取50µl培养液涂布于AP的麦康凯培养基。
⑶重组质粒转化组：取50µl、100µl、150µl培养液分别涂布AP的麦康凯培养基（各3、4、3个）。 2.当菌液完全被培养基吸收后（大约10min）倒置培养皿，于37℃恒温培养24~36h，观察菌落生长情况。
（六）重组子的挑取与复证
1.取一个含有氨苄青霉素的麦康凯培养基平板，在底部划线分成6个区域，并分别编号； 2.在涂有重组质粒转化组的平板上分别选取6个单个的白色转化子，用牙签挑取单菌落点接到平分成6份的含有氨苄青霉素的麦康凯培养基平板上，37℃过夜培养。同时，在点接6个单菌落时随机选取4个，分别接种到含有5ml带氨苄青霉素的LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。 3.观察培养后的平板，看菌落是否均为白色。从4支试管中，选择平板上白色菌落所对应的任意两试管，分别取3ml菌液，用Omega试剂盒抽提重组质粒DNA，具体步骤见说明书； 4.电泳检测：2.0µl重组质粒 + 1.5µl loading buffer + 1.5µl重蒸水，混合均匀，点样。
+
+
+-
注意事项
➢ 本实验属于微量操作，用量极少的步骤必须严格注意吸取量的准确性并确保样品全部加入反应体系中。 ➢ 实验中所用塑料器材都必须是新的，并且经过高温灭菌，操作时打开使用，操作过程中要注意环境干净，戴手套操作，尽量减少走动，缩短Ep管开盖的时间。 ➢ 不论是酶切还是连接反应，加样的顺序应该是：先加双蒸水，其次是缓冲液和DNA，最后加酶。且前几步要把样品加到管底的侧壁上，加完后可适当离心将其甩到管底，而酶液要在加入前从-20℃的冰箱取出，酶管放置冰上，取酶液时吸头应从表面吸取，防止由于插入过深而使吸头外壁沾染过多的酶液。取出的酶液应立即加入反应混合液的液面以下，并充分混匀。 ➢ Ep管的盖子应盖紧，防止水浴过程中水汽进入管内，并做好标记以防样品混淆。
➢ 制备凝胶时，应避免琼脂糖溶液在微波炉里加热时间过长，否则溶液将会暴沸蒸发，影响琼脂糖浓度。制胶前需要把制胶槽擦拭干净，倒胶时要迅速并避免气泡产生。 ➢ 上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部的凝胶刺穿。也不要快速挤出吸头内的样品，避免挤出的空气将样品冲出样品孔。 ➢ 溴化乙锭是一种强烈的诱变剂，有毒性，使用含有这种染料的溶液时，应带上乳胶手套进行操作。勿将溶液滴洒在台面上，实验结束后用水彻底冲洗干净。 ➢ 实验中加样后应及时更换枪头，以避免试剂的污染。
➢ PCR反应高度灵敏，应设法避免污染，如戴一次性手套操作，使用一次性PCR管和吸头，反应加样区应与DNA模板制备区及PCR产物电泳检测区分开。 ➢ PCR管单加样时，对于非常微量的样品一定将样品加在管壁上或者液体中，防止漏样。
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实验结果与分析
（一）载体与外源片段限制性酶切反应实验结果
表3：电泳中从左至右点样顺序表
泳道 样品 样量（µl） 1 λ/HindⅢ (Marker) 2 λDNA 3 λ/HindⅢ 4 pUC19 5 pUC19 /HindⅢ 6 7 8 JD-3 10.0 … … 16 pUC19 /HindⅢ 10.0 17 λ/HindⅢ JD-1 JD-2 10.0 10.0
图1：酶切电泳图
第1泳道是标准λDNA酶切产物的条带，第2泳道为未酶切的λDNA的条带，第3泳道和第17泳道是自己的λDNA经HindIII酶切后的产物的条带，第4泳道是未酶切的pUC19质粒，第5泳道为商品pUC19经HindIII酶切产物的条带，第16泳道为之前的实验中pUC19酶切产物的条带，其余泳道均为各小组碱变性法提取的pUC19质粒经HindIII酶切后的产物的条带。
第9泳道为我们小组提取的pUC19质粒经HindIII酶切产物的条带，从图中可以看出：自下而上有两条主带，分别为超螺旋的pUC19质粒（与第4泳道最亮的条带平齐，处于marker中2027bp线性条带所对应位置偏下），以及被HindIII切开的线性pUC19质粒（与第5泳道最亮的条带平齐，
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处于marker中2322bp与4361bp线性条带所对应位置之间）。两条主条带相比，被HindIII切开的线性pUC19质粒对应的条带的亮度不及超螺旋的、未被HindIII切开的条带亮度的2/3,可以看出酶切并不彻底，仍有大量未被切开的质粒存在，可能是由于酚抽提过程中未除尽，降低了限制性核酸内切酶HindIII的活性。为了保证连接步骤的顺利进行，我们选用商品pUC19被HindIII酶切后的片段作为载体（第5泳道对应片段，几乎全部为线性DNA片段），进行下一步的连接反应。在两条主条带之上，隐约可以看到一条微弱的条带，为开环质粒或复制中间体。点样口中为酶切时加入的酶以及质粒提纯过程中未除尽的蛋白质，经EB插入在紫外灯下也会有荧光。
（二）重组子筛选结果
表4：转化后各平板的菌落状况分析表
编号 受体菌对照组 50μL 平板 现象 结果分析 感受态细胞对氨苄青霉素敏感，实验结果说明感受态细胞有活性，且未掺杂对氨苄有抗性的杂菌，可正常使用。 培养基呈橘红色，-麦氏Ap 菌落均呈白色， 铺满平板表面 麦氏Ap +培养基呈红色， 无菌落生长 pUC19质粒对照组 50μL 麦氏Ap +转入pUC19的受体细胞具有氨苄抗性，且由于α互补作用的存在， 培养基呈红色， 具有β-半乳糖苷酶活性，可分解单菌落为红色 乳糖产酸，使麦氏培养基中指示剂显红色，故单菌落呈红色。 用于与实验组中菌落颜色对比。 重组质粒转化组 50μL×3 重组质粒转化组 100μL×4 培养基呈红色， 既有白色单菌落 +麦氏Ap 又有红色单菌落。 接种用量越多， 单菌落数量越多。 平板上生长的菌落全部为转化子，具有氨苄抗性。其中非重组子，能利用乳糖，菌落为红色，与pUC19质粒对照组一致；重组子不能利用乳糖，只能利用蛋白胨产生碱性物质，菌落为白色。 重组质粒转化组 150μL×3
（三）单菌落平板结果
挑取重组质粒转化组平板中的白色单菌落进行复证时，在单菌落平板中发现1~5号菌落为白色，6号菌落为红色。说明在挑取单菌落对6号点菌的时候，挑取到了平板上的红色菌落，用6号菌培养的细菌培养液应为非重组子培养液，只能提取出空载体质粒。1~5所对应的细菌培养液可用于下一步的质粒抽提与验证过程。
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（四）重组子质粒抽提、电泳结果
泳道 样品 样量（µl） 1 λ/HindⅢ(Marker) 8.0 2 pUC19 100ng 3、4 JD-1 2.0 5、6 JD-2 2.0 7、8 JD-3 2.0 … … 表5：从左至右点样顺序 图2：试剂盒快速抽提重组质粒电泳图
第1泳道为λ/HindIII的电泳条带（marker），第2泳道为pUC19质粒,即空载体的电泳条带，为超螺旋结构，其余各组为用试剂盒快速提取得到的重组质粒，均为超螺旋结构。
我们小组的提取的重组质粒在第9、10泳道，对应两条最亮的条带是超螺旋结构的重组质粒。与第2泳道的空载体位置相比，第9泳道的超螺旋条带与空载体位置相同，说明第九泳道中超螺旋的质粒应为pUC19空载体质粒，其中未插入外源DNA片段。观察复证实验中所做的平板，发现1~5号菌落均为白色，6号菌落为红色，说明在选择质粒进行抽提时，可能因编号没有对应好，所以错误的提取了6号菌落培养的质粒，导致提取的质粒为空载体质粒。与第2泳道的空载体位置相比，第10泳道的超螺旋条带位于空载体对应位置的上部，与空载体位置极为接近。同时与其他各实验组对比，第10泳道超螺旋条带的位置与Marker中2027bp的片段位置相近，最靠近下部，说明该质粒插入了最小的外源λ/HindIII片段，可依靠之后的PCR验证进一步确认。同时在主条带之上还有有一条微弱的亮带，为重组质粒的开环结构或复制中间体。
Omega试剂盒提取质粒具有显著的优点，与碱变性法提取质粒相比较，碱变性法是从30mL菌液中得到50μL质粒，而试剂盒法从3mL菌液中得到50μL质粒，在点样量相同的情况下其超螺旋条带的亮度均约商品pUC19的3倍。因此试剂盒法不但方便快捷，耗时少，而且提取质粒得率比碱提取法提高了10倍左右，其纯度也得到了极大的提高。
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