LC-AFS法对动物源性食品中硫柳汞残留量的测定

肖亚兵;秦德元;王伟;秦洪建;许泓

【摘 要】建立了动物源性食品中硫柳汞残留量的LC-AFS分析方法.样品经酸、碱提取液提取,液相色谱分离后,先与氧化剂混合,再与空气混合,通过紫外光照射,硫柳汞被氧化成无机汞,最后与还原剂和盐酸发生氢化反应,进入原子化器,进行原子荧光测定.对样品前处理条件、液相色谱条件、氧化剂和原子荧光工作条件进行了考察.在优化实验条件下,硫柳汞在0～20μg/L范围内线性关系良好,相关系数为0.9994,检出限为(S/N=3)0.4μg/L.5种样品在10.0、20.0、40.0μg/kg 3个加标水平下的平均回收率为71%～83%,相对标准偏差(RSD)为1.6%～4.5%.该法适用于动物源性食品中硫柳汞残留量的测定.%A LC - AFS method was developed for the determination of thimerosal residues in foods of animal origin. The analyte in sample was extracted with the acidic and basic extraction solutions,and separated by liquid chromatography. Thimerosal was mixed with oxidizing reagent and air, then exposed to UV light, and oxidized to inorganic mercury. After hydride generation reaction, the atomized mercury could be determined by atomic fluorescence spectrometry (AFS). Sample

preparation, mobile phase, oxidizing reagent and operating conditions of AFS were optimized. Under the optimal conditions, the calibration curve for thimerosal was linear over the concentration range of 020 μg/L with a correlation coefficient of 0. 999 4. The detection limit was 0. 4 μg/L. The average recoveries of thimerosal from five samples spiked at three levels of 10. 0, 20. 0, 40. 0 μg/kg were in the range of 71％ -83％ with RSDs of 1.6％

-4. 5％. The method was suitable for the determination of thimerosal residues in foods of animal origin. 【期刊名称】《分析测试学报》 【年(卷),期】2011(030)006 【总页数】4页(P661-664)

【关键词】LC-AFS;动物源性食品;硫柳汞;残留 【作 者】肖亚兵;秦德元;王伟;秦洪建;许泓

【作者单位】天津出入境检验检疫局,天津,300461;北京吉天仪器有限公司,北京,100015;天津出入境检验检疫局,天津,300461;天津出入境检验检疫局,天津,300461;天津出入境检验检疫局,天津,300461 【正文语种】中 文

【中图分类】O657.72;O614.243

硫柳汞(Thimerosal)是一种含汞的有机化合物，以质量计含汞49.6%，有杀菌消毒作用，在某些疫苗的生产中常被用作防腐剂。自1930年以来，人们使用硫柳汞预防疫苗被细菌和其他微生物污染，在整个预防接种过程中，除可能会有轻微的皮肤过敏反应外，无可归因于硫柳汞的不良反应。硫柳汞对疫苗的安全性起了很大作用，然而，硫柳汞通过注射途径对动物具有一定的毒性［1］。相关毒性作用和毒性机理知识的缺乏使疫苗中硫柳汞的危险性难以确定，但不能排除婴儿接触疫苗中硫柳汞的累积作用引起细微神经发育异常和肾脏损伤的可能性［2］。世界卫生组织(WHO)、美国公共卫生署(PHS)等机构已启动减少和消除疫苗中使用硫柳汞的计划［3］，我国农业部第235号公告也规定了硫柳汞在所有食品动物中作疫苗防腐

剂的使用浓度不得超过0.02%。因此，为保证动物源性食品的安全，应建立对动物源性食品中的硫柳汞残留量进行检测的分析方法。

目前针对疫苗中硫柳汞的检测方法主要有化学滴定法［4］、分光光度法［5－6］、原子吸收光谱法［7－8］、液相色谱法［9－11］、电感耦合等离子体发射光谱(ICP－OES)［12］等。化学滴定法无需特殊设备，成本低，但手工操作步骤多，较为繁琐，人为影响因素较多，且灵敏度较低。另外，该方法使用的部分试剂如三氯甲烷、四氯化碳对人体有毒害。比色法成本低、操作较简单，但灵敏度低，且只适合于基质简单的样品，对于动物源性复杂样品的干扰大。原子吸收法只能检测总汞的含量，要准确检测硫柳汞的含量必须先通过色谱将硫柳汞分离出来。液相色谱法定量准确，但灵敏度低，对于基质复杂的样品干扰大。ICP－OES也仅限于疫苗中硫柳汞的检测。而液相色谱－原子荧光(LC－AFS)联用技术具有灵敏度高、选择性好、线性范围宽且仪器成本低、操作便捷等特点，已成功应用于汞形态的检测［13－16］。本研究建立了动物源性食品中硫柳汞残留量的LC－AFS测定方法，旨在为食品安全和质量评价提供方法依据。 1.1 仪器、试剂与样品

形态分析预处理装置、原子荧光光谱仪、高压液相泵(北京吉天仪器有限公司);高速均质器(德国IKA公司);LD4-2型离心机(北京医用离心机厂);涡旋混合器(美国Fisher公司);超纯水仪(美国Millipore公司);0.45 μm滤膜(直径47 mm，美国Millipore公司)。乙腈、甲醇为色谱纯;盐酸为优级纯;乙酸铵、半胱氨酸、氢氧化钾、硼氢化钾、硫脲、氯化钾、过硫酸钾均为分析纯;硫柳汞标准品(纯度不小于97%，上海化学试剂厂);实验用水为超纯水。猪肉、鸡肉、羊肉、猪肝、牛奶均为市售。 1.2 溶液的配制

载流(7%盐酸);还原剂(0.5%氢氧化钾－2%硼氢化钾):称取氢氧化钾5 g、硼氢化钾

20 g溶于水中，并稀释至1 000 mL混匀;氧化剂(0.5%氢氧化钾－0.3%过硫酸钾):称取氢氧化钾5 g、过硫酸钾3 g溶于水中，并稀释至1 000 mL混匀;清洗液:取甲醇10 mL，倒入90 mL水中，混匀;碱提取液(5%氢氧化钾－0.5%硫脲):称取氢氧化钾50 g、硫脲5 g溶于水中，并稀释至1 000 mL混匀;酸提取液(20%盐酸－1%硫脲－0.15%氯化钾):取盐酸200 mL，硫脲10 g、氯化钾1.5 g溶于水中，并稀释至1 000 mL混匀;流动相(5%乙腈－0.462%乙酸铵－0.12%半胱氨酸):取盐酸50 mL，乙酸铵4.62 g、半胱氨酸1.2 g溶于水中，并稀释至1 000 mL混匀;标准储备液:准确称取硫柳汞标准品100 mg于100 mL容量瓶中，用超纯水在超声波水浴中溶解，配制成1 000 mg/L的标准储备液;标准工作液:使用前将上述储备液用超纯水稀释至所需浓度。 1.3 实验条件

LC条件:色谱柱:C18柱(150 mm×4.60 mm，5 μm);流速:1.0 mL/min;进样量:100 μL;流动相:5%乙腈－0.462%乙酸铵－0.12%半胱氨酸。 形态分析预处理装置条件:泵速:65 r/min;紫外灯(UV):开。

原子荧光联用条件:总电流:30 mA;负高压:300 V;载气流速:600 mL/min;屏蔽气流速:1 000 mL/min。 1.4 样品处理

称取2.5 g(精确至0.01 g)试样于50 mL离心管中，加10 mL碱提取液，均质2 min，10 000 r/min离心5 min，将上清液转移至25 mL容量瓶中。向残渣中加入5 mL碱提取液，在涡旋混合器上充分混合后，10 000 r/min离心5 min，将上清液转移至25 mL容量瓶中。再向残渣中加5 mL酸提取液，充分混合，10 000 r/min离心5 min后，合并上清液于25 mL容量瓶中，用盐酸或氢氧化钾调节pH为4.0～7.0，用水定容。此溶液过0.45 μm滤膜后，供液相色谱－原子荧光光谱测定。

2.1 提取条件的优化

目前用作有机汞提取液的主要有HCl、NaOH和KOH，络合剂有半胱氨酸和硫脲，提供Cl－的有KCl和NaCl。通过实验发现，只用HCl溶液提取时，提取过程中部分硫柳汞转化为无机汞，导致形态分析不准确;而只用KOH溶液提取时，尽管提取过程中元素形态比较稳定，但提取率和回收率偏低(约60%)。综合考虑，本实验先用5%氢氧化钾－0.5%硫脲提取，剩余样品残渣再用20%的HCl溶液提取，提取液合并后测定，此时样品的加标回收率为75%左右。 2.2 流动相的选择

实验选用适当的络合剂与样品中的硫柳汞反应，使之形成非极性化合物后在C18柱上分离。常见的络合剂有吡咯烷二硫代氨基甲酸铵(APDC)、L-半胱氨酸、巯基乙醇，由于L-半胱氨酸的亲水性较强，其与汞形成的络合物在C18柱上保留较弱，检测时间较短，故本实验选取L-半胱氨酸作为络合剂。此外，络合剂的浓度对汞形态的分离和保留有很大影响，若络合剂的浓度太低，其与汞化合物的络合反应不完全，未络合化合物会与C18柱上残余的硅羟基相互作用而被保留，从而降低进样的重复性;适当提高络合剂的浓度，可避免这种保留，使汞形态能较快流出且灵敏度有所提高;但若络合剂浓度过高，会引入杂质，使得汞形态的痕量分析难以进行。通过对实验条件的优化，最终选择5%乙腈－0.462%乙酸铵－0.12%半胱氨酸为最佳流动相，其中乙酸铵为缓冲盐、半胱氨酸为络合剂。图1为该条件下硫柳汞标准溶液的色谱图。 2.3 K2S2O8浓度的选择

本实验需在紫外照射条件下加氧化剂进行消解，将有机汞氧化成无机汞进行测定。本文选择K2S2O8为氧化剂，通过在0.5%KOH中加入不同浓度K2S2O8，考察了不同浓度氧化剂对体系荧光强度的影响，结果见图2。从图中可以看出，当K2S2O8含量为0.2%时，灵敏度最高，此后出现一个平台。本实验选择0.3%的

K2S2O8作为氧化剂。

2.4 原子荧光光谱仪工作条件的选择

2.4.1 光电倍增管负高压及灯电流的选择 实验表明，增大光电倍增管负高压可提高荧光强度，但噪声也相应增大，即增大负高压不能改善信噪比;荧光信号随灯电流的增大而增强。综合考虑灵敏度、灯的使用寿命、发射谱线的自蚀现象以及汞的空白值(100～200 mV之间为宜)等因素，本实验选择负高压为300 V，灯电流为30 mA。

2.4.2 载气流速的选择 载气在氢化反应过程中起2个重要作用:①将反应产生的氢化物带入到原子化器中;②提供氩氢火焰燃烧需要的氩气。考察了载气流速为200～900 mL/min时对荧光强度的影响。结果发现，当载气流速为600 mL/min时，灵敏度最高，继续增大载气流速则灵敏度下降。实验选择最佳载气流速为600 mL/min。

2.4.3 屏蔽气流速的选择 考察了屏蔽气流速分别为600、700、800、900、1 000、1 100 mL/min时对荧光强度的影响。结果表明，荧光强度随屏蔽气流速的增加而增加，当屏蔽气流速达900 mL/min时，灵敏度出现一个平台，此后增加趋缓。本文选择屏蔽气的最佳流速为1 000 mL/min。

2.4.4 硼氢化钾质量浓度的选择 选择加液时间为10 s，考察了硼氢化钾质量浓度在1.0～30.0 g/L范围内对5 μg/L汞标准溶液荧光强度的影响，结果见表1。从表1可以看出，随着硼氢化钾质量浓度的增大，荧光信号值也随之升高，当达到20.0 g/L时，汞的荧光信号最大。之后随着硼氢化钾质量浓度再升高，荧光信号开始降低。因此实验选择硼氢化钾溶液的质量浓度为20.0 g/L。 2.5 方法的线性范围、回归方程与检出限

在最佳实验条件下，取一系列不同浓度的硫柳汞标准溶液进行线性回归实验。结果表明，硫柳汞的峰面积(Y)与其质量浓度(X，μg/L)在0～20 μg/L范围内线性关系

良好，线性方程为Y=5.97×106X+2.97×106，相关系数(r)为0.999 4，检出限(S/N=3)为0.4 μg/L。 2.6 实际样品的分析

在优化条件下，按照实验方法对猪肉、鸡肉、羊肉、猪肝和牛奶5种市售样品进行10.0、20.0、40.0 μg/kg 3种加标水平的回收率测定，结果见表2。从表2可见，在此5种基质中，方法的回收率为71%～83%，相对标准偏差为1.6%～4.5%。

【相关文献】

［1］ 黄银君，王振海，戈银生．硫柳汞的毒性研究［J］．动物毒物学，1998，13(1/2):68－70． ［2］ KANG S H，KIM H．Simultaneous determination of methylparaben，propylparaben and thimerosal by high-performance liquid chromatography and electrochemical detection［J］．J Pharm Biomed Anal，1997，15(9/10):1359 －1364．

［3］ 刘纳，译．美国儿科学会/美国公共卫生署1999年关于乙型肝炎疫苗中含有硫柳汞的联合声明［J］．中国计划免疫，2001，7(3):185．

［4］ 中国生物制品标准化委员会．中国生物制品化学检定规程［M］．北京:化学工业出版社，2000．

［5］ SHRIVASTAW K P，SINGH S．A new method for spectrophotometric determination of thiomersal in biologicals［J］．Biologicals，1995，23(1):65 －73．

［6］ 全爱顺，辛暨华，李文波，车玉杰．比色法测定硫柳汞含量的试验考察［J］．中国生物制品学杂志，1998，11(3):172－174．

［7］ 杨晓华，刘英华，王玉春．流动注射氢化物发生－原子吸收法测定乙肝疫苗中硫柳汞的含量［J］．中国药房，2008，19(13):1013－1014．

［8］ 金玉兰，陈哲文，马福荣，冷继平，魏葆华．冷原子吸收法检测硫柳汞含量［J］．中国生物制品学杂志，2005，18(5):422－423．

［9］ COSTA L，VEGA M，DIAZ Y，MARCELO J L，HERNANDEZ J M，MARTINO T．Reversed phase high performance liquid chromatography versus spectrophotometric assay for thimerosal in cuban recombinant hepatitis B vaccine［J］．J Chromatogr:A，2001，907(1/2):173－186．

［10］ TLEUGABULOVA D，GONZALEZ PEREZ I．Reversed phase high performance liquid chromatographic study of thimerosal stability in cuban recombinant hepatitis B vaccine

［J］．J Chromatogr:A，1996，729(1/2):219 －228．

［11］ 汪海峰，鞠兴荣，黄凯云．高效液相色谱测定疫苗中硫柳汞［J］．理化检验:化学分册，2005，41(11):743－745．

［12］ DOS SANTOS E J，HERRMANN A B H，DOS SANTOS A B，BAIKA L M，SATO C S，TORMEN L，STURGEON R E，CURTIUS A J．Determination of thimerosal in human and veterinarian vaccines by photochemical vapor generation coupled to ICP OES［J］．J Anal At Spectrom，2010，25(10):1627 －1632．

［13］ 尚晓虹，赵云峰，张磊，李筱薇，吴永宁．水产品中汞元素形态的液相色谱－冷蒸气发生原子荧光光谱分析法［J］．卫生研究，2010，39(3):321－325．

［14］ 吕超，刘丽萍，董慧茹，李筱薇．盐酸提取－液相色谱－原子荧光联用技术检测水产品中甲基汞等汞化合物［J］．分析试验室，2010，29(2):64－68．

［15］ 毛红，秦德元．高效液相色谱－原子荧光光谱法测定英国FAPAS鱼肉中甲基汞［J］．中国卫生检验杂志，2009，19(10):2246－2247．

［16］ 刘庆阳，何滨，胡敬田，江桂斌．高效液相色谱与原子荧光光谱联用分析海产品中的甲基汞［J］．分析试验室，2009，28(5):41－44．