２０１７年（第３８卷）第８期 一株大肠杆菌的分离与鉴定 梅京京 ，韩海锋 ，王龙飞’，张丹’。吴庭才 ，李小康。 （１．漯河市畜牧直属分局，河南漯河４６２０００，２．漯河市动物卫生监督所，３．河南科技大学） 摘要：选取洛阳自然保护区野生成年白鹭，通过无菌采取其口腔拭子和肛门拭子进行细菌的增殖，得到３ 株分离菌，再对其进行分离培养、染色镜检、生化鉴定及药敏试验。分离茵在麦康凯培养基上形成边缘整齐表 面光滑湿润的红色菌落，革兰氏染色呈阴性。分离菌使甘露醇、鼠李糖、甘油、麦芽糖、甘露糖、乳糖、蔗糖、半乳 糖、葡萄糖及棉籽糖发酵变为黄色；该茵具有明胶酶，使明胶水解生成多肽再水解为氨基酸，使明胶液化。吲哚 试验呈阳性反应；Ｖ—Ｐ试验为阴性；ＭＲ试验为阳性。药物敏感性试验结果为对青霉素、庆大霉素、环丙沙星、氧 氟沙星、链霉素５种药物均为高度敏感。 关键词：野生禽类；大肠杆菌；分离；生化鉴定；药敏试验 中图分类号：￥８５２．６１＋２ 文献标识码：Ｂ 文章编号：１００４—５０９０（２０１７）０８—００１０—０２ 大肠杆菌病是由大肠杆菌埃希氏菌的某些致病菌引起 的疾病总称，常引起禽类局部或全身性感染如心肌炎、肝周 滴加草酸铵结晶紫染色液，经１～２ ｍｉｎ水洗；加革兰氏碘 液与抹片上媒染，经ｌ～３ ｍｉｎ，水洗；加９５％酒精与抹片 上脱色，约１ ｍｉｎ，水洗；加１０倍稀释石炭酸复红液复染 炎、气囊炎、败血症、脐带炎、眼炎和卵黄陛腹膜炎等。目前， 禽源大肠杆菌的研究资料绝大多数来源于家禽。有关野生 １～２ ｍｉｎ，水洗；吸干或烘干，用１００倍的油镜进行菌体形 态和染色特性的观察；革兰氏阳性细菌呈蓝紫色，革兰氏 阴性细菌呈红色…。 １．６生化鉴定 禽源大肠杆菌的系统性研究相对较少。但随着集约化养殖 的急剧发展和环境污染的加剧，野生禽类也频发此病，对养 禽业的发展和野生禽类的保护影响甚大。选取洛阳自然保 护区野生成年白鹭进行试验研究，旨在为野生禽类大肠杆菌 病的防治和野生动物的保护提供一定参考。 １材料和方法 １．１病料 制备生化试验培养基，将分离纯化过的待检菌分别进 行糖类发酵试验即生化反应，主要包括蔗糖、麦芽糖、甘露 醇、乳糖、葡萄糖、Ｖ—Ｐ试验、吲哚试验及ＭＲ试验。用挑 菌环挑取菌液并溶于各生化管中，根据条件的不同放置不 洛阳自然保护区管理处提供的野生成年白鹭的口腔 黏液和粪便。 １．２器材与试剂 同设定的恒温培养箱中，培养２４ ｈ或４８ ｈ后观察。 １．７药敏试验 该试验所用方法为ＣＬＳＩ推荐的Ｋ～Ｂ法进行，将分离 超净工作台、恒温培养箱、营养琼脂、糖发酵（分解）试 验试剂及指示剂、Ｖ—Ｐ试验试剂、甲基红（ＭＲ）试验试剂、 纯化鉴定过的待检菌在血清肉汤培养基中３７ｃｃ下培养１２ ｈ， 然后用微量移液器取２０ ｌ菌液于ＬＢ培养皿中，用Ｌ棒涂 抹均匀，贴上药敏片，在３７℃恒温培养箱内培养ｌ５～ ２４ ｈ，再用直尺测量其抑菌环的直径，判断标准参考 ＮＣＣＬＳ药敏纸片扩散法。抑菌圈直径＞１５ ｍｍ为高度敏 感；在１０—１５ ｍｍ为中度敏感；抑菌圈直径＜１０ ｍｍ为低度 敏感［２ ３。 ２结果与分析 吲哚试验试剂、革兰氏染色液、蛋白胨、牛肉膏等。 １．３细菌分离与培养 无菌采取疑似病例的粪便和口腔黏液，加入适量生理 盐水，在无菌操作台中用接种环接种于麦康凯琼脂平板， 在３７℃恒温培养箱中培养ｌ０～１５ ｈ进行培养与分离。 １．４细菌增殖 无菌操作，将麦康凯培养基中的红色单一菌落接种于 ＬＢ液体培养基中，３７℃摇床培养７～８ ｈ。观察生长状况， 放置冰箱保存备用。 １．５革兰氏染色 ２．１培养特性 病原菌在麦康凯琼脂平板上形成的菌落边缘整齐或 波形，稍凸起，表面光滑湿润，直径大约２．０ ｍｍ，呈红色， 因待检菌发酵乳糖而产酸，使中性红指示剂变红色，长出 无菌操作，用接种环ＬＢ液体培养基中的菌液，涂于 载玻片上，用酒精灯固定；在已干燥、固定好的玻片上， 红色菌落。在普通的ＬＢ培养基上，则长出表面光滑无色 半透明菌落。 坷南需牲兽鏖 ２．２革兰氏染色 ２０１７年（第３８卷）第８期 脂平板上，形成中等大小，表面光滑湿润的粉红色菌落 ］。 其相关试验结果与该次试验结果相一致。２０１３年李双双 等人对兔源大肠杆菌进行鉴定，该菌镜检结果为革兰氏阴 性，两端钝圆，呈单个或多个散在排列；该菌在普通培养基 上形成表面光滑、边缘整齐、湿润半透明的灰白色圆形突 在油镜下观察革兰氏染色结果为红色短杆菌，无芽孢 和荚膜，单独和成对存在。 ２．３生化鉴定 生化试验结果显示：细菌使甘露醇发酵变为黄色；使 鼠李糖、甘油、麦芽糖、甘露糖、乳糖、蔗糖、半乳糖、葡萄糖 及棉籽糖发酵变为黄色；该菌具有明胶酶，使明胶水解生 成多肽再水解为氨基酸，使明胶液化。该菌含有色氨酸 酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成Ⅱ引哚，加入对二甲基氨 基苯甲醛试剂时，形成红色的玫瑰吲哚。该菌在分解葡萄 起菌落，在麦康凯琼脂平板上形成红色、中等大小、表面光 滑、湿润的单个菌落Ｈ 。因此，根据细菌形态和培养特性 的研究，可初步确定该分离株为大肠杆菌。 该试验除采用常规细菌分离培养方法外，还进行了一 系列生化鉴定试验以便对其进行进一步的验证，鉴定试验 结果为该分离株能利用鼠李糖、甘油、麦芽糖、甘露糖、乳 糖、蔗糖、半乳糖、葡萄糖及棉籽糖；Ｖ—Ｐ试验阴性，ＭＲ试 糖过程可产生乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物， 使甲基红指示剂变红。该菌的生化试验结果与大肠杆菌 的特征基本一致，见表１。 表１生化试验结果 验为阳性，吲哚试验阴性。参照《伯杰氏细菌鉴定手册第 八版》标准及《肠杆菌科生化鉴定编码手册》，此生化鉴定 结果表明该分离株的生化特性与大肠杆菌的生化特性相 一致。２０１５年孙蓉蓉等人对水貂大肠杆菌进行分离鉴 定，其生化鉴定试验结果为分离菌均可分解葡萄糖、乳糖、 麦芽糖、甘露醇，产酸产气，大部分菌株还可利用蔗糖； Ｖ—Ｐ试验阴性，ＭＲ试验为阳性，吲哚试验阴性 ，与该次 试验结果相一致。２０１３年达娃次仁等人对西藏牦牛源大 肠杆菌进行分离鉴定，其生化鉴定结果为分离菌能利用葡 萄糖、甘露醇、乳糖、蔗糖和麦芽糖；ＭＲ试验阳性，Ｖ—Ｐ试 验阴性，吲哚试验阳性 ，与该次试验结果相一致。至此 可基本确定该分离菌为大肠杆菌。 该研究还对待检菌进行了药物敏感性试验，结果表 明，该分离菌对青霉素、庆大霉素、环丙沙星、氧氟沙星、链 霉素５种药物均为高度敏感。说明该分离株对这几种抗 生素的耐药性都比较低，可能是由于该野禽生存和活动的 环境抗生素污染并不严重。该次的药敏试验结果可为维 护公共卫生安全提供帮助，也可为该保护区野生禽类大肠 杆菌病的防治提供依据。 参考文献： ［１］郭伶，代竹青．一例鸡大肠杆菌的分离与鉴定［Ｊ］．中国 药物 抑菌圈直径／ｍｍ 敏感性 畜牧兽医，２０１０，３７（１）：１８４—１８５． ［２］胡仕凤，雷红宇，宁玲忠，等．鸡大肠杆菌病的诊断与防 治［Ｊ］．养禽与禽病防治，２００５，（５）：１５． ［３］刘华，祁克宗，朱良强，等．一株孔雀源大肠杆菌分离鉴 定与致病特性初步研究［Ｊ］．安徽农学通报，２０１０，１６（９）： ２７－２９． 注：判断标准参考ＮＣＣＬＳ药敏纸片扩散法。抑茵圈直 径＞１５ ｍｍ为高度敏感；处于１０—１５ ｍｍ为中度敏感；小于 １０ ｍｍ为低敏感。 ［４］李双双，贺志沛，罗俊娜，等．兔源大肠杆菌的分离鉴定 及药物敏感性检测研究［Ｊ］．江西农业学报，２０１３，２５（８）： ７０－７２． ３讨论 该试验通过革兰氏染色确定该分离菌为革兰氏阴性 短杆菌，且能在ＬＢ培养基和麦康凯培养基上迅速生长，并 出现与大肠杆菌一致的生长特征。２０１０年刘华等人对一 株孔雀源大肠杆菌进行分离鉴定，该株孔雀源大肠杆菌的 镜检结果为两端钝圆，多数散在排列，偶有２～３个连在一 ［５］孙蓉蓉，邹玲，刘文华，等冰貂大肠杆菌的分离鉴定及 药敏试验［Ｊ］．安徽农业科学，２０１５，４３（１１）：１２５—１２６． ［６］达娃次仁，格桑卓玛，贡嘎，等．牦牛源大肠杆菌西藏分 离株的血清型鉴定［Ｊ］＿黑龙江畜牧兽医，２０１３，６２（２１）： 】６０－１６】． 起的革兰氏阴性短杆菌；该菌株的培养特性为在麦康凯琼 （收稿日期：２０１７—０６—２５） 浮 “ ｌｌ¨ ～＿ 一