维普资讯 http://www.cqvip.com 齐齐哈尔医学院学报２００７年第２８卷第２Ｏ期 原位杂交检测Ｂ细胞淋巴瘤免疫球蛋白轻链限制性 杨书云（综述）何松（审校） Ｂ细胞淋巴瘤在非何杰金氏淋巴瘤约占７０ ９／６～ ８０ ，包括弥漫性大Ｂ细胞性淋巴瘤（ＤＩ ＢＣＬ）、套 细胞淋巴瘤（ＴＣＩ ）、Ｂｕｒｋｉｔｔ’Ｓ淋巴瘤（ＢＬ）、滤泡性 淋巴瘤（ＦＬ）、其他类包括Ｂ一小淋巴细胞性淋巴瘤／ 泌学等领域。 ２ Ｂ淋巴细胞免疫球蛋白轻链及检测 ２．１免疫球蛋白轻链的限制性Ｂ细胞分化早期， 抗原受体基因的重排在Ｂ细胞中合成免疫球蛋白， 慢性淋巴细胞性白血病（Ｂ—ＳＩ Ｌ／ＣＬＬ）、淋巴浆细 胞性淋巴瘤（ＬＰＬ）以及粘膜相关性淋巴组织淋巴瘤 （ＭＡＬＴ）＿１］。诊断淋巴瘤除了常规组织形态学镜下 诊断外还常常必须借助免疫组织化学技术（Ｉｍｍｕ— ｎｏｈｉｓｃｈｅｍｉｃａｌ，ＩＨＣ）、原位杂交（ｉｎ ｓｕｉｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａ— ｔｉｏｎ，ＩＳＨ）、ＰＣＲ等辅助方法。检测免疫球蛋白轻链 、 的限制性是证实Ｂ淋巴细胞肿瘤性即克隆性增 生的方法之一，原位杂交技术检测免疫球蛋白轻链 ｍＲＮＡ基因序列，对淋巴瘤是诊断和鉴别诊断意义 非常重大，国内外均有文献报道ｌ＿２＿”ｊ。现综述如下。 １原位杂交技术 １．１ 原位杂交技术原理 原位杂交技术（ＩＳＨ）是以 同位素、生物素、荧光素、抗体、半抗原及其他特异性 化合物标记的特异ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ为探针，在 染色体、细胞原位研究核酸的分布、数量、表达形态 及其他同细胞的分化、病理生理状态、形态特征演化 之间关系的分子生物学技术。其基本原理是组织内 经热变性而呈单链状态的ＤＮＡ或ｍＲＮＡ能在适宜 条件下，按硷基配对原则［Ａ—Ｔ或Ｇ—Ｃ］借氢键与 同源的互补ＤＮＡ、ＲＮＡ探针重新结合杂交，然后以 一定的方式将结合了探针的靶ＤＮＡ、ＲＮＡ显示出 来。 １．２ 原位杂交技术的特点 ＩＳＨ最大的特点是杂 交可以直接在组织切片上进行。杂交后的信号可在 光镜、电镜及荧光显微镜下观察，结合组织、细胞的 形态结构，可直接观察到某基因序列在某类型细胞 中的位置和数量。这样，定性、定量，又在空间上可 定位。另因不经核酸提取，特异性核酸不致因稀释 而导致假阴性结果；不破坏组织形态结构，能较精细 的定位靶ＤＮＡ或ＲＮＡ。不仅能检测多种结构蛋 白、功能酶、激素、受体的编码基因ｍＲＮＡ的分布部 位、数量复制状态及其同编码的产物水平之间的相 互关系等，而且还能够了解癌基因的位置、表达水 平、表达机制及其同癌细胞分化转移之问的关系，在 染色体水平可检测出易位的染色体片段，也能检测 出单拷贝的癌基因或整合的病毒基因。正因为上述 的优点，这一技术已经普遍应用于遗传学、微生物 学、细胞或分子生物学、肿瘤病因病理学、神经内分 作者单位：江苏省南通市肿瘤医院病理科 邮 编２２６３６１ 收稿日期２００７—０８—１０ 在Ｔ细胞中合成ＴＣＲ。免疫球蛋白分子是一个多 聚体，它由两个重链与两个轻链（ 或 ）的多肽链组 成。在不同的阶段或同一阶段上产生几种不同类型 的重链，但轻链都为同一型，即 或 。人类编码 、 轻链基因分别位于２、２２号染色体上，由８５个Ｖ 基 因片段、５个Ｊ 基因片段及一个Ｃ 基因和５０—１００ 个ＶＸ基因片段、７个ＪＸ—Ｃ 基因构成。在Ｂ细胞 中免疫球蛋白基因顺序性地重排，在前一前Ｂ阶段 开始出现免疫球蛋白重链重排，前Ｂ阶段开始出现 免疫球蛋白轻链重排，即先出现Ｉｇ重链基因重排， 接着是轻链重排。ｌｇ 常先重排，功能性重排成功后 则抑制ＩｇＸ的重排（反之亦然）。这种分子机制使一 个成熟Ｂ细胞仅能表达一种免疫球蛋白轻链。因此 免疫球蛋白轻链是Ｂ淋巴细胞肿瘤性增生还是反应 性增生的重要指标。肿瘤性增生时呈限制性表达， 即只有一条轻链 或 表达，相反如果检测结果为 和 都看到表达，则没有限制性，为增生性病变。因 此在Ｂ细胞淋巴瘤中，免疫球蛋白轻链 和 往往 呈特异性限制性表达，是Ｂ细胞单克隆性增生的标 志＿２“ ］。６—７最近国外有报道少数Ｂ细胞性肿瘤 可以存在轻链蛋白的双表达，结果有待进一步观 察 。 ２．２ 限制性检测方法及比较运用ＩＨＣ的方法从 蛋白质水平检测，判断其限制性有无，检测阳性细胞 为细胞浆内淡黄色或棕色颗粒。但是结果背景模 糊，容易因为假阳性或假阴性的增加而误诊或漏诊。 轻链限制率不高，一般只有５０ 左右，有的甚至更 低，国外早先用ＩＨＣ法检测轻链限制性稍高些，一 般在６０ ９／６左右＿７ 。国内外目前这方面的报道基 本没有了，属于被淘汰的一种方法学。 多聚酶链反应（ＰＣＲ）检测Ｂ细胞的克隆性增生 主要是用于免疫球蛋白重链ＩｇＨ基因重排，其灵敏 度一般小于８０ ９／６，特别是滤泡生发中心细胞起源和 中心细胞后Ｂ细胞起源的淋巴瘤。检测免疫球蛋白 轻链 、 的基因重排率不高，半巢式ＰＣＲ检测ＩｇＨ、 Ｋ、 分别为７４、５６．５、４３．５ ］。另外ＰＣＲ技术实验 室要求高，不能进行形态学以及相关基因在细胞内 的定位观察。此法更适用于实验室研究工作，在临 床病理实际应用中可行性小。 ＩＳＨ法在常规石蜡切片上检测轻链 、 的ｍＲ— 维普资讯 http://www.cqvip.com ・２４８６・ ＮＡ，阳性细胞定位准确，背景清晰，限制性的判断可 靠而灵敏。国内报道限制率约为６０ ～８０ ，国外 文献报道偏高，可达９０ 左右［４ “］。 ３ ＩＳＨ检测免疫球蛋白轻链限制性的应用 Ｂ细胞淋巴瘤中轻链蛋白．ｃ、入呈限制性表达， 是Ｂ细胞肿瘤性增生的标志。ＩＳＨ的应用不仅可以 证实Ｂ细胞淋巴瘤的诊断，同时可以广泛用于淋巴 结病变的诊断与鉴别诊断。 ３．１ ＭＡＬＴ型Ｂ细胞淋巴瘤 国内外文献报道最 多的是淋巴结外粘膜相关淋巴样组织淋巴瘤 （ＭＡＬＴ型），包括发生在胃、脾脏、鼻咽、肺等部位 粘膜组织内淋巴组织。这类肿瘤以前曾被误诊为淋 巴组织反应性增生或假性淋巴瘤，其本质是滤泡边 缘区Ｂ细胞淋巴瘤．该类肿瘤背景成分杂，常规组织 形态学诊断困难。应用ＩＳＨ法根据．ｃ、入阳性细胞数 的比值确定其限制性 ］。 ３．２ 滤泡性淋巴瘤（ＦＬ） 滤泡反应性增生与滤泡 性淋巴瘤鉴别诊断一直是淋巴瘤诊断中的难点。滤 泡生发中心Ｂ细胞增生活跃，是为克隆性增生判断 还是反应性增生，仅凭组织形态学很容易误诊。除 了借助于免疫组化ＢＣＬ一２等抗体外，轻链蛋白．ｃ、入 的ｍＲＮＡ限制性判断具有更可靠的参考价值 川。 ３．３ 弥漫大Ｂ细胞性淋巴瘤（ＤＬＢＣＬ） ＤＬＢＣＬ 是一大类病变，细胞背景复杂，结构紊乱。有时容易 与一些非肿瘤性破坏淋巴结结构的炎症性病变相混 淆；间变性大Ｂ细胞性淋巴瘤有时需与Ｔ细胞性淋 巴瘤、少数组织细胞肉瘤等鉴别。 ３．４组合性淋巴瘤的诊断 近年国外文献报道过 几例，同一解剖部位淋巴结同时发生滤泡性淋巴瘤 （ＦＬ）和套细胞淋巴瘤（ＭＣＬ），应用ＩＨＣ和ＦＩＳＨ确 定轻链蛋白的克隆性增生ｌ】 。 ３．５ 细胞学上的应用 ＩＳＨ一直可以用于细胞穿 刺标本淋巴细胞轻链蛋白限制性检测，其检测的结 果定位清晰，数据可靠＿】 引。 ４ ＩＳＨ应用情景 由于轻链蛋白．ｃ、入的ｒｎＲＮＡ序列检测可以在 福尔马林固定的石蜡切片上进行，极大方便了淋巴 瘤的诊断和鉴别诊断，是一非常有用的淋巴瘤诊断 的辅助方法。同时，原位杂交技术本身可以用常规 的福尔马林固定液的标本石蜡切片进行，为淋巴瘤 的其他标记物和其他肿瘤相关的癌基因，如ＢＣＬ一 ６、ＢＣＬ一１０、Ｐｌ６、Ｐ２１、ＥＲ、ＰＲ等等，从分子水平上 检测ｔｕＲＮＡ或ＤＮＡ序列提供了可能。 参 考 文 献 ［１］ 朱雄增，李晓秋．恶性淋巴瘤分类和诊断进展『Ｊ］．临床与实验 病理学杂志，２００６，２２（３）：２６２—２６５ ［２］ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｃ，Ｐｏｒｃｕ Ｐ，Ｃａｌｉｇｕｉｒｉ ＭＡ，ｅｔ ａ１．Ｉｎ ｓｉｔｕ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂ—ｃｅｌｌ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ａｎｄ ｋａｐｐａ／ｌａｍｂｄａ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｅｘｐｒｅｓ— ｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ：ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｔｉｌｉｔｙＥＪ］．Ｄｉａｇｎ ＭＯＬ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｑｉｑｉｈａｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，２００７，Ｖｏ１．２８，Ｎｏ．２０ Ｐａｔｈｏｌ，２００１，１０：１７１．一１７８ ［３３ Ｂｅｃｋ ＲＣ，Ｔｕｂｂｓ ＲＲ，Ｈｕｓｓｅｉｎ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＣＩＳＨ）ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（Ｉｇ） ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌ ｄｙｓｃｒａｓｉａｓ ａｎｄ ｎ０ｎ—Ｈｏｄｇｋｉｎ ｉｎ ｌｙｍｐｈｏｍａ［－Ｊ－］．Ｄｉａｇｎ Ｍｏｌ Ｐａｔｈｏｌ，２００３，１２： １４—２Ｏ ［４］ Ｌｅｏｎｇ ＡＳ．Ｙｉｎ Ｈ，Ｈａｆａｊｅｅ Ｚ．Ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｔａｉ— ｎｉｎｇ ｉｎ ｐａｒａｆｆｉｎ－－ｅｍｂｅｄｄｅｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ［－Ｊ＂］．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，２００２，１０ （１）：１１０—１１４ ［５］ Ａｍａｒａ Ｋ；Ｔｒｉｍｅｃｈｅ Ｍ；Ｚｉａｄｉ Ｓ，ｅｔ ａ１．ＰＣＲ—ｂａｓｅｄ ｃｌｏｎａｌｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｂ—ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ ｉｎ ｐａｒａｆｆｉｎ－－ｅｍｂｅｄｄｅｄ ｔｉｓｓｕｅｓ： ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｋａｐｐａ ａｎｄ ｌａｍｂｄａ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｇｅｎｅ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｒｅ— ｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，２００６，２０２（３）：４２５—４３１ ［６］ Ｘｕ Ｄ．Ｄｕａｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｌｉｇｈｔ—ｃｈａｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｂ—ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓＥＪ＂］．Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏ— ｇＹ＆Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００６，１３０：８５３～８５６ ［７］ Ｍａｒｇｏ Ｃ，Ｃｒｏｗｓｏｎ ＡＮ，Ｐｏｒｃｕ Ｐ，ｅｔ ａ１．Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｋａｐｐａ ａｎｄ ｌａｍｂｄａ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｂ—ｃｅｌｌ ｃｌｏｎａｌｉｔｙ ｉｎ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｂ—ｃｅｌｌ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅｓ：ｉｔｓ ｕｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ＂］．Ｊ Ｃｕｔａｎ Ｐａｔｈｏｌ，２００３，３０：５０４—５１１ ［８］ Ｗｅｉｓｓ Ｌ Ｍ，Ｓｐａｇｎｏｌｏ Ｄ Ｖ．Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｃｌｏｎａｌｉｔｙ ｉｎ ｌｙｍｐｈ— ｏｉｄ ｐｒ０ｌｉｆｅｒａｔｉ０ｎ［Ｊ］．ＡＭ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ，１９９４，１４２（５）：１ ６９７—１ ６８２ ［９］ Ｐｌａｎｋ Ｌ，Ｈｅｌｌ Ｋ，Ｈａｎｓｍａｎｎ ＭＬ，ｅｔ ａ１．Ｒｅａｃｔｉｖｅ ｖｅｒｓｕｓ ｎｅｏ— ｐｌａｓｔｉｃ ｍｏｎｏｃｙｔｏｉｄ Ｂ－－ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｉｎ ｓｕｉｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｍＲＮＡ［Ｊ］．Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ，１９９５，１０３（３）：３３０—３３７ ［１０］ Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｈ，Ｌｅｅ ＭＤ，Ａｄｉｎａ Ｃｉｏｃ ＭＤ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｉｎ ｆｉｎｅ——ｎｅｅｄｌｅ ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ——ｔｙｐｅ ｐｒｅｐａ— ｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂ——ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ ｂｙ ｍＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ［ｊ］．Ａｐｐｌ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｍｏｒｐｈｏｌ，２０Ｏ４，１２（３）：ｚ５２— ２５８ ［１１］ Ｈａｎｓ Ｋｏｎｒａｄ Ｍｕｌｌｅｒ—Ｈｅｒｍｅｌｉｎｋ，Ｅｕｇｅｎｉａ Ｈａｒａｌａｍｂｉｅｖａ， Ｔｈｏｍａｓ Ｒｉｉｄｉｇｅｒ．Ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｍａｒｇｉｎａｌ Ｚｏｎｅ Ｌｅｓｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｙｍｐｈ Ｎｏｄｅ Ｂｅｎｉｇｎ ｏｒ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ？［Ｊ］．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｃａｓｅ ｒｅ— ｖｉｅｗｓ，２００４，９（２）１８５—１９１ ［１２］ Ｈａｎｓ Ｋｏｎｒａｄ Ｍｕｌｌｅｒ—Ｈｅｒｍｅｌｉｎｋ，Ｅｕｇｅｎｉａ Ｈａｒａｌａｍｂｉｅｖａ， Ｔｈｏｍａｓ Ｒｉｉｄｉｇｅｒ，Ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｍａｒｇｉｎａｌ Ｚｏｎｅ Ｌｅｓｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｙｍｐｈ Ｎｏｄｅ Ｂｅｎｉｇｎ ｏｒ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ？［Ｊ］．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｃａｓｅ ｒｅ— ｖｉｅｗｓ，２００４，９（２）１８５—１９１ ［１３］ Ａｌｂｅｒｔｏ Ｚａｍｏ，Ｒｏｂｅｒｔａ Ｚａｎｏｔｔｉ，Ｍａｕｒｉｚｉｏ Ｌｅｓｔａｎｉ，ｅｔ ａ１．Ｍｏｌｅｃ— ｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉ０ｎ ｏｆ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｍａｎｔｌｅ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｌｙｍｐｈｏｍａ［－Ｊ＂］．Ｖｉｒｅｈｏｗｓ Ａｒｃｈｉｖ，２００６，４４（８）：６３９—６４３ ［１４］ Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｈ，Ｉ ｅｅ ＭＤ，Ａｄｉｎａ Ｃｉｏｃ ＭＤ，ａｔ ａ１．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｉｎ ｆｉｎｅ——ｎｅｅｄｌｅ ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ——ｔｙｐｅ ｐｒｅｐａ— ｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂ——ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ ｂｙ ｍＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ［Ｊ］．Ａｐｐｌ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｍｏｒｐｈｏｌ，２００４，１２（３）：２５２— ２５８ ［１ ５］ Ｓｔｅｗａｒｔ ＣＪ，Ｆａｒｑｕｈａｒｓｏｎ ＭＡ，Ｋｅｒｒ Ｔ，ａｔ ａ１．Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｍＲＮＡ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ ｉｎ ｄｉａｇｎｏｓ— ｔｉｃ ｆｉｎｅ ｎｅｅｄｌｅ ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ ｃｙｔｏｌｏｇｙ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９９６，４９（４）７４９—７５４ ［１６］ Ｌｅｅ ＬＨ，Ｃｉｏｃ Ａ，Ｎｕｏｖｏ ＧＪ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｒｅ— ｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｉｎ ｆｉｎｅ——ｎｅｅｄｌｅ ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ——ｔｙｐｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｂ－－ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ ｂｙ ｍＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｉｍ— ｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，２００４，１２： ２５２—２５８