基于微卫星标记的西方蜜蜂抗螨蜂种群体遗传多态性分析

No. 4

西南师范大学学报（自然科学版）

Journal of Southwest China Normal University (Natural Science Edition)

2017年4：月Apr. 2017

DOI：10. 13718/j. cnki. xsxb. 2017. 04. 006

基于微卫星标记的西方蜜蜂

抗螨蜂种群体遗传多态性分析^

张祖芸、余玉生、

杨若鹏％

陈玲3，

张学文1

宋文菲、

王艳辉、

1.云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所，云南蒙自661101; 2.红河学院生命科学与技术学院，云南蒙自661100;3.云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，昆明650201

摘要：为了分析西方蜜蜂抗螨蜂种的群体遗传多态性情况，采用18对微卫星（SSR)引物对抗螨蜂种子一代和子二代，并与同场饲养不抗螨的本地意蜂和浙大蜜浆高产蜂种进行比对，共计22个群体进行遗传多样性检测.结果表明：遗传一致度在0.2时，抗螨蜂种子代发生一定的分化，其他两个品系基本一致.抗螨蜂种子代之间的亲缘关系较近（遗传距离在0.043 9以内），与本地意蜂和浙大蜜浆高产蜂种各自相互分开.从而对抗螨蜂种的选育和保护具有重要的指导意义.

关键词：西方蜜蜂；抗螨蜂种；遗传多样性；微卫星标记中图分类号：S892

文献标志码：A

文章编号：1000 - 5471(2017)04 -0031 -07

西方蜜蜂抗蛾蜂种（AmeZZi/era, varroa-resistant honeybees)是由法国引进，通过集团选育而成，对 大蜂蛾(VarroaDe^rwcto)有很强的抵抗力[1]. Danka等，Rinderer等，De Guzman等研究得出该蜂种具有 抗蛾能力较强、不易盗蜂、能耐受低温天气、易分蜂性等生物学特性[2^4]. Biichler等对抗蛾蜂种也进行了 广泛研究，通过大量的选育措施和雄蜂选择筛选出抗蛾力强的蜂种[5].在国内，谢宪兵等应用中华蜜蜂的 蜂王浆饲喂意蜂工蜂小幼虫等技术培育出抗蛾力高于亲本的营养杂交蜂种[6].卢焕仙等对抗蛾蜂种（由法 国引进)进行饲养观察，对其种性和适应性、抗蛾性进行了观察研究[7].另外，笔者对抗蛾蜂种第一代蜂王 适应性和繁殖能力进行了研究，得出该蜂种秋繁和春繁能力较强，较浙大蜜浆高产蜂种第一代王繁殖略 好[8].并对抗蛾蜂种子代形态特征进行测定分析，得出抗蛾蜂种子代颜色较深，与浙大蜜浆高产蜂种和本 地意蜂差异显著[9].

近年来，随着蜂蛾危害的加重，加之化学杀虫剂的频繁使用，对蜂产品存在潜在的污染等问题，如何 提高我国蜂产品质量，如何采取科学的选育措施培育出抗蛾能力强的蜂种，已成为我们饲养西方蜜蜂生产 实践和品种保存中首要解决的突出问题.因此，需要弄清抗蛾蜂种群体的遗传多样性和遗传背景.因为对 抗蛾蜂种群体进行遗传多态性检测，可为抗蛾蜂种的种群进化、品种保存、抗蛾机理研究等方面提供理论 依据.目前，蜜蜂群体遗传多样性研究常用的分子技术主要有微卫星DNA标记技术，有方便快速检测等 优点，因此，能广泛应用于动植物的遗传多样性研究、遗传图谱的构建、亲缘关系鉴定等分子辅助育种领 域[1°]. Al-Otaibi通过ISSR标记技术构建UPGMA系统发生树，分析表明抗蛾蜂种种群间和种群内存在明 显的遗传变异[11].本研究采用微卫星标记技术分析抗蛾蜂种群体遗传多样性，结合当地饲养的两个生产性

①收稿日期：2016 - 06 - 17

基金项目：国家蜂产业技术体系专项（CARS-45-SYZ 17).

作者简介：张祖芸（1984 -)，女，云南新平人，硕士研究生，助理研究员，主要从事蜜蜂生物学及分子育种的研究. 通信作者：张学文，副研究员.

32西南师范大学学报（自然科学版)http：//xbbjb. swu. edu. cn第42卷

能比较优良的蜂种作对照，以期为其品种资源的评估和利用提供理论依据.

1

1. 1

材料与方法

材料

在云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所西方蜜蜂试验蜂场和个旧蛮耗交尾场采集抗蛾蜂种一代（以品系 名首字母命名，即Km-Fl)6群，抗蛾蜂种二代（Km-F2)6群，浙大蜜浆高产蜂种（mj)4群，本地意蜂(Be)6 群，共计22群，每群采集100只，放人无水乙醇浸泡保存于一80 °C冰箱.

1.2

方法

DNA基因组提取、检测等试验方法参照赵亚周等[12_13]和杨洁等[14]的实验操作，本研究引物采用Soli- gnac等相关文献报道[15_18]或NCBI检索，最终选择18对多态性较好的SSR引物（表1)，所用引物先后由 生工生物工程（上海）有限公司提供.

表1 18对微卫星座位信息及其PCR扩增条件

微卫星座位AP189AP274A48A3 5A24AP297AP92A113AP43A14AP313AP63A28AP243A107AT101AC181AC124

登录号AJ509433AJ509486AJ509259AJ509251AJ509241AJ509499AJ509364AJ509290AJ509329AJ509239AJ509504AJ509348AJ509244AJ509466AJ509287AJ509549AJ509699AJ509673

引物序列（5^ — 33

F：TCCCACCTTCACCCTATCG

R：GCTTCTTTCCTTCTCGAGTCTCF：ATATCCCGGTGGCCACGTR：TGTCGCCACGCATAACTCGF：GAACAACGTTGTCGCGTGR：CTTGCTCCCACACGCTCTF：GTACACGGTTGCACGGTTGR：CTTCGATGGTCGTTGTACCCF：CACAAGTTCCAACAATGCR：CACATTGAGGATGAGCGF：GGGTTGAGATGCTAGAAACGAR：CGTCTATTGGAAGAAACGCTGF：CTGTTATTGCTCCCATCGCR：ACCTGAGGTCATACGCGACF：CTCGAATCGTGGCGTCCR：CCTGTATTTTGCAACCTCGCF：GGCGTGCACAGCTTATTCCR：CGAAGGTGGTTTCAGGCCF：GTGTCGCAATCGACGTAACCR：GTCGATTACCGATCGTGACGF：TAGCGCCCTAACGTCCAACR：CCCTTCTACCACCGACGCF：CGTCCTTTCTCGGTCCACTR：GACAGCTACGTGGAACGGAF：GAAGAGCGTTGGTTGCAGGR：GCCGTTCATGGTTACCACGF：AATGTCCGCGAGCATCTGR：TGTTTACGAGAATTCGACGGGF：CCGTGGGAGGTTTATTGTCGR：GGTTCGTAACGGATGACACCF：GCGTTCCAAGTGAATGAACAR：GTTGGCTATTTTCGTATCGCF：CGACGATTGTTAAGTTCAATAACR：GTCGGATTCGAGACGAGGF：CCTGTTCGTGAATTACTGTAAAGR：TTGCCTCGTAAAATTCTAACC

染色体Chr LG10Chr LG3Chr LG9Chr LG14Chr LG7Chr LG12Chr LG15Chr LG6Chr LG3Chr LG8Chr LG4Chr LG2Chr LG14Chr LG1Chr LG7Chr LG12Chr LG11Chr LG13

镁离子浓度

(mmol • L 1 )

2. 01. 22. 01. 22. 01. 21. 21. 52. 01. 71. 51. 21. 72. 02. 01. 52. 01. 5

退火温度

/°C

555558575550506060585660545658505050

.第4期张祖芸，等：基于微卫星标记的西方蜜蜂抗螨蜂种群体遗传多态性分析33

?〇尺反应总体积为1〇,止.，其中.10，？€及:：&成&1'(?^：!+浓度15.111111〇1：/1^1..〇..丨止，（11'^?8(2.5 111〇1。1/14

1. 0 fiL，引物(20 pi加1/L:)各 0(5」儿，rTaq 酶(:& U/;止),丄，模板 1 ;』L，ddH20 6.句

» H预变性5 min, gg °C变性.30 s.，.》，〜仰t：退火3Q s, 72 f延伸3Q s, #35个循环;,:豪后72 C延伸 10 min，15 \"\"C:.冷却 5 .min，4 °G.保每•

取PCR产物& f』L以2. 0 %的琼脂糖凝胶电泳进行检测，得到较纯的DMA，条带清晰，稳定性好.再 进行8%聚丙烯胺凝胶电泳检测分析，然后银染显色，最后照相保存；

1.

3

数据分析

对图谱（图1和图幻上的扩増条带进行读数，在相同的迁移率位餐上，有带为I，无带为〇,形成〇，1

数据矩阵.再利用NTSYS-2, l〇e,poPGene32软件和ANOVA等软件进行遗传多态性评价•

图1. SSR产物聚丙烯酰胺凝肢电泳检测结泉（一>

^ r T

一.

二二

—* *

，.

5

i- < 1 •

t -41..i. im

图2 SSR产物聚丙稀酰胺.凝胶电沐检测结果(:二）

2

2.1

结果与分析群体聚类分析

经过读带发现，样品共有22个群体.首先利用NTSYS-2. 10e软件对22个群体迸行了初步分析，得到

一个聚类图（图3).可以看出所有群体的遗传一致度在CL 2时，具有相似的遗传背.患结合两个采集地点进 行分析，发现抗螨蜂种子代之间出现一定程度的分化，旦抗螨蜂种子代為同场饲养的浙大蜜浆高产蜂种亲 缘关系较近，与不词采集地点的本地意蜂相对较远.

2.

2

群体间遗传一致度和遗传距离

对22个群体进行遣传一致度和遗传距离计篱，得出Nd氏遗传一致度为0. 935 4〜0. 958 7 (,_ 2)，都

在:〇. 9以J；,遗传相似性较高、本地意蜂与'钪螨峰种二代遗传一致度最低，为0. 93:5 4，本地意蜂与蜜魏禽 产蜂种遗德一致度最高，为〇. 958 ?.遗传距离为(L 042 2—6.與6 g(表:2),说明抗靖蜂种F1代和本地意 蜂、浙大蜜楽高产蜂种遗传距离较小（0. W以上>,F2代与浙大蜜楽高产蜂种遗传距离较太(0• 〇6以上X

34 西南师范大学学报（自然科学版） http ://xbbjb. swu. edu. cn 第42卷

| Bel

I I Be5

_______ \\----------------------- Be2

_______ _________________ Be4

------------ --------------------------------------Be3— -------------------------------------------------KmFlb— -------------------------------------------------------------Be6

____________________________________________ mj2

------------------------------------------------mj3

------- ------------------------------------------------mj4

--------------------------------------------------------------------------------------KmFld

------- --------------------------------------------------------------------KmF2c

____________________________________________ KmF2e

______ __________________________ KmF2d

_______ ________________ __________________________ KmFla

___ _________________________________ KmFlc~__________________________________________________ KmFle

________

-----------

|

____________________________________________________________|

|

|

|

|

|

|

|

|

|

|

|

|

|

|

|

|

|

|

_____________________________________________ __________________________________________________

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

_________________________________________________________________________________________

-----------------------------------mJ!

|

KmFlf

KmF2aKmF2bKmF2f

0.200 0.165 0.130

Coefficient

0.094 0.059

图3 22个群体基于SSR多态性的初步聚类分析树状图

表2 4个品系样品的Nei氏遗传一致度和遗传距离

Km-Fl

Km-FlKm-F2Bemj

2.3

Km-F20. 957 0* ■x•餐苌0. 066 80. 063 9

Be0. 958 10, 935 4餐苌关关0. 012 2

mj0. 951 70. 938 10. 958 7■x- -x- -x- *

关兴关关0. 043 90, 042 80. 045 9

品种间群体的聚类分析

利用表2所列各群体的遗传距离进行UPGMA聚类分析，得出遗传多态性聚类图（图4)，4个类型共

聚为2个大的类群，抗螨蜂种子代之间聚为一个分支，本地意蜂和蜜浆高产蜂种聚为另一个分支.

Be

mj

Km-F2

Km-Fl

0.056 0.052 0.049

Coefficient

0.046 0.042

图4 4个品系蜜蜂样品遗传多态性聚类图

第4期

2.4

张祖芸，等：基于微卫星标记的西方蜜蜂抗螨蜂种群体遗传多态性分析35

品种间遗传多样性统计

对实验样品的数据进行多样性统计，可见抗螨蜂种子一代和子二代比较接近，它们的遗传多样性水平

明显要比其他两个群体遗传多样性高一些，本地意蜂和蜜浆高产蜂种的各项多样性指标比较接近(表3).

表3

品种

样本量

西方蜜蜂各品系种群的遗传多样性统计

有效等位基因Ne

观测等位基因数NaNei氏基因多样性H0. 342 3士0. 162 90. 350 4士0. 1M 50. 317 4士0. 157 30. 338 5 士0. 163 80. 363 6士0. 132 9

Shannon’s 指数 J0. 505 9士0. 210 40. 519 9 士 0. 184 30. 478 0士0. 203 60. 501 5 士0. 210 30. 537 5士0. 170 9

Km-FlKm-F2Bemj

整体水平

72727248264

1. 964 3士0. 186 41. 964 3士0. 186 41. 955 4士0. 207 41. 946 4士0. 226 2

2

1. 602 9 士 0. 341 01. 607 7士0. 315 71. 539 3士0. 330 91. 596 9士0. 352 11. 638 4士0. 312 9

2.5

品系间的Nei氏遗传变异分析

4个品系之间出现了一定程度的遗传分化(表4)，遗传分化系数Gw为0.073 8,即遗传变异有7. 38%

存在居群间，有92. 62%遗传变异存在居群内.再由Gw值推导出的3个群体间的基因流Nw较高，为 6. 274 7>1.

表4 4个品系群体SSR多样性Nei氏分析

总基因多样性

平均值标准差

品系内基因多样度

遗传分化系数Gm

基因流Nm

0. 364 00. 019 7

0. 337 10. 016 8

0. 073 86. 274 7

2.6

品系间的主成分分析

根据表2中4个类型群体的遗传一致度数据进行主成分分析，第一主成分所占的总变异度为63. 49%，

第一主成分占24. 99%，累积高达88. 48%，因此，可以作为主成分反映品系群体间的遗传多态性信息.以 此作图，可将4个品系分为2个类群（图5)，与聚类分析结果（图4)基本一致，且各品系间的遗传多态性信 息更加细化，相互之间的分化状况更加直观.抗螨蜂种一代和二代与本地意蜂和蜜浆高产蜂种相互分开.

图5 基于SSR的西方蜜蜂各品系样品的主成分分析

2.7

群体方差分析

从表5中得出群体间的遗传变异占16. 15% (P<0.001)，而群体内的遗传变异占83. 85% (P<

0. 001).说明4个品系蜂种的遗传变异主要来自蜂群内部.

36 西南师范大学学报（自然科学版）

表5 AMOVA分析

变异来源品系间品系内

自由度318

平方和0. 416 71. 219 3

均方

http://xbbjb.swu.edu.cn 第42卷

方差分量0. 013 00. 066 7

贡献率/%16. 1583. 85

0. 1390. 068

3讨 论

本研究中的抗蛾蜂种子代之间的血统亲缘关系最近(遗传一致度为0.957 0,遗传距离为0.043 9)，可 能是由于母本来源于同一个祖先，而与本地意蜂和蜜浆高产蜂种较远.4个品系间种群的聚类树状图（图4) 和主成分分析（图5)显示，所有样品共聚为2个大的分支，抗蛾蜂种子代之间聚为一支，本地意蜂和蜜浆高 产蜂种聚为一支.这与4个品系蜂种的生物学特性、外部形态特征分析的结果相符[9].据实际观察和前期 形态测定结果，抗蛾蜂种子代的体色较深，本地意蜂次之，蜜浆高产蜂种较浅[9].因此，该结果表明SSR 标记可以用于抗蛾蜂种遗传多态性的研究，还可以进一步研究种内不同品系间的系统起源和发育.

根据Nei氏基因多样性H和Shannon’s指数J可以得知：抗蛾蜂种的遗传多样性水平要比其他两个 群体遗传多样性水平高一些，说明抗蛾蜂种的遗传多样性较高，能够为选育优良的抗蛾蜂种提供丰富的基 因资源.4个品系总群体的遗传多样性水平不高，有一定的遗传分化，遗传分化系数GM为0.073 8,表明 居群内遗传分化大于居群间的遗传分化，群体分子方差分析也表明了 4个品系蜂种的遗传变异主要来自蜂 群内部.本试验结果表明，4个品系蜜蜂群体的总基因流Nm(6.274 7)>1，即说明由于群体间的基因交流 程度比较频繁，防止了品系间遗传分化的进一步发生.此外，这与本蜂场生产实践相符，因为是常年定地 饲养的蜂场，蜂群小转地追花夺蜜，所以群体之间基因交流现象非常频繁[19i°].另外，抗蛾蜂种子代与同 场饲养的浙大蜜浆高产蜂种亲缘关系较近，与不同采集地点的本地意蜂相对较远.

致谢：本研究实验过程在云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所完成，受到程在全教授及该课 题组全体老师不倦的教诲和热情帮助，在此表示诚挚的感谢！

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Genetic Diversity Analysis of Mite-Resistance Honeybees

(Apis mellif era) Based on Microsatellite Markers

ZHANG Zu yun1 ? YANG Ruo-peng2 ? CHEN Ling3， YU Yu-sheng1 ?

SONG Wen-fei1， WANG Yan-hui1 ? ZHANG Xue-wen1

1 • Sericultural and Apicultural Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Mengzi Yunnan 661101, China ；2 • College of Life Science and Technology, Honghe University, Mengzi Yunnan 661100 , China；3. Research Institute of Biotechnology & Genetic Germplasm，Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650223, ChinaAbstract： Varroa-resistant honeybees of A. mellif era L. has a strong resistance to Varroa destructo ,

which were named as FI and F2. Firstly the genetic diversity of FI and F2 was investigated with 18 micro­satellite markers. Secondly, the mite-resistance bees of the local A. mellif era (Yunnan, Southwest Chi­na) and the high yield bees of royal jelly breed from Zhejiang University (East China) were chosen for comparison analysis. The results show, in 22 sample colonies, when Nei's genetic identity index exceeded 0. 2, distinct genetic divergence was found filial generation of mite-resistance bees, while other breeds were the same nearly. The FI and F2 of mite-resistance bees had a close descent relationship (the genetic dis­tances between them were 0. 0439) , with the local A. mellif era and the high yield bees of royal jelly breed from Zhejiang University separated from each other.

Key words： A. mellif era L. ； mite-resistance bees； genetic diversity； SSR makers

责任编辑周仁惠