DNA的提取与保存方法

2．建议裂解红细胞后再冻存于－80度。因为冻融后红细胞会裂解，而且红细胞会增加蛋白污染，影响DNA抽提

3．我们实验室加ACD抗凝血液，保存3年了，抽提DNA没问题（我们是先离心后分层保存，以便后续试验）！

血DNA提取技术

分离外周血白细胞提取方法：

试验步骤：

1、取人肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm离心10min。

2、小心吸取上层血浆，分装到3个0.5ml离心管中。

3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min。

4、2500rpm离心10min，弃上清。

5、加入10ml溶血液，摇匀，冰浴15min。

6、3000rpm离心10min，弃上清。

7、倒置离心管，去掉残液。

8、得白细胞，－80?C冻存。

试验要求：

血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h，4℃放置不超过5h，以防白细胞自溶。

氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA：

试验试剂：

Ligsisbuffer：

133mMNH4ClNHCl7.12g0.9mMNH4HCO3NH4HCO30.071g0.1mMEDTA0.5mMEDTA0.2ml；最后加灭菌去离子水至1000ml，高压灭菌。

ACD抗凝剂：柠檬酸1.68g柠檬酸钠4.62g葡萄糖5.15g；最后加灭菌去离子水至350ml，高压灭菌。

提取缓冲液（Extractionbuffer）：

10mMTrisCl(PH=8.0)1MTris.Cl(PH=8.0)1ml0.1mMEDTA(PH=8.0)0.5mMEDTA(PH=8.0)20ml0.5%SDS10%SDS0.5ml；最后加灭菌去离子水至100ml，高压灭菌

试验步骤：

1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl，充分颠混至清亮。以4000rpm，离心5min。弃上清液。

2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl，充分匀浆。以6000rpm，离心5min。

3、彻底弃去上清，加入extractionbuffer500μl（裂解细胞），混匀置于37℃，水溶1h。

4、加入8μl的蛋白酶K，颠混，37℃过夜（或55℃，3h，但是37℃效果要好些）。

5、每管加入450μl饱和酚（取溶液下层）缓慢摇晃10min，以5500rpm，离心15min。

6、取上清，每管加入250μl饱和酚和250μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。

7、取上清，每管加入500μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。

8、取上清，每管加50μl的3M的NaAC＋，适量无水乙醇（预冷）至满，摇匀放入-20℃保存2h以上。

9、以12000rpm，离心20min。去上清，加入70％乙醇500μl，以12000rpm，离心5min，去上清，50－60℃干燥。

10、加入50μl灭菌去离子水，转弹，混匀。

NaI提取法提取外周血白细胞基因组：

实验步骤：

1、取外周抗凝血（全血）100ul于eppendorf管中，12000rpm离心12min。

2、弃上清，加双蒸水200ul溶解，摇匀20s。

3、混匀后加6MNaI溶液200ul，摇匀20s。

4、加入氯仿/异戊醇（24：1）400ul，边加边摇，摇匀20s，12000rpm离心12min。

5、取上层液350ul，加入另一新eppendorf管中，加0.6倍体积异丙醇，摇匀20s，室温放置15min，静置后的反应体系15000rpm离心12min，使沉淀紧贴eppendorf管壁。

6、弃异丙醇，加70％乙醇1ml（不振动），以15000rpm离心12min。

7、弃乙醇，敞开eppendorf管盖，烘干（37℃恒温箱）后，加1xTE溶液30ul，溶解DNA＞12h以上，制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。

从外周血提取DNA是一个经常遇到的问题，当然可以用试剂盒提取，不过代价还是有点大，并且不方便，定试剂总要等上几天，如果血液标本不稀缺资源，不妨用一些简便方法提取。 方法一

(1) 取抗凝血5ml在沉淀中加入15ml PBS，混匀，离心2000r/min10min。 (2) 将血浆转至新的试管中，-70℃保存。

(3) 将血细胞转入另一支试管中(10ml或50ml)加入尽可能多的冷的蒸馏水混匀。 (4) 将其插入冰内5～10min或放入-20℃15min。

(5) 将上述混合液从冰中或-20℃取出放至室温，离心2000r/min20min。 弃上清，收集沉淀。

(7) 在沉淀中加入15ml PBS，混匀，离心2000r/min10min。 此步骤重复3次至沉淀为淡红色或白色。

将沉淀转入小管，加少量PBS，每分钟5000r/min离心5min，去上清。 (9)沉淀-70℃保存。

常用的外周血白细胞基因提取方法：

试验原理：

苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在1/103mol/LNaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。

试验步骤：

1、将1mlEDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入5ml离心管中，加入1ml磷酸缓冲盐溶液（PBS），混匀，3500rpm离心15min,倾去含裂解红细胞的上清。重复一次。用0.7mlDNA提取液混悬白细胞沉淀，37℃水浴温育1h。

2、将上述DNA提取液混悬白细胞，37℃水浴温育1h后，加入1mg/ml蛋白酶K0.2ml,至终浓度为100-200ug/ml,上下转动混匀，液体变粘稠。50℃水浴保温3h，裂解细胞，消化蛋白。保温过程中，应不时上下转动几次，混匀反应液。

3、反应液冷却至室温后，加入等体积的饱和酚溶液，温和地上下转动离心管5-10min，直至水相与酚相混匀成乳状液。5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复酚抽提一次。加等体积的氯仿：异戊醇（24：1），上下转动混匀，5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复一次。

4、加入1/5体积的3mol/LNaAc及2倍体积的预冷的无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管，即有乳白色云絮状DNA出现。用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA，转入另一1.5ml离心管中，加70%乙醇0.2ml，以5000rpm离心5min。洗涤DNA，弃上清，去除残留的盐。重复一次。室温挥发残留的乙醇，但不要让DNA完全干燥。加TE液20ul溶解DNA,置于摇床平台缓慢摇动，DNA完全溶解通常需12-24h。制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。

真核细胞DNA的制备

一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。

根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：

1、防止和抑制DNase对DNA的降解。

2、尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。

试剂准备：

1、TE:10mMTris-HCl(pH7.8);1mMEDTA(pH8.0)。

2、TBS:25mMTris-HCl(pH7.4);200mMNaCl;5mMKCl。

3、裂解缓冲液：250mMSDS;使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。

4、20%SDS

5、2mg/ml蛋白酶K

6、Tris饱和酚（pH8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿

7、无水乙醇、75%乙醇

试验步骤：

材料处理：

1、新鲜或冰冻组织处理：

1)取组织块0.3-0.5cm3,剪碎，加TE0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。

2)将匀浆液转移到1.5ml离心管中。

3)加20%SDS25ml，蛋白酶K(2mg/ml)25ml，混匀。

4)60°C水浴1-3hr。

2、培养细胞处理：

1)将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。

2)离心4000g×5min，去除上清液。

3)加10倍体积的裂解缓冲液。

4)50-55°C水浴1-2hr。

DNA提取：

1、加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。

2、离心5000g×10min，取上层水相到另一1.5ml离心管中。

3、加等体积饱和酚，混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。

4、加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。

5、加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。

6、加1/10体积的3M醋酸钠（pH5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。

7、待絮状物出现后，离心5000g×5min，弃上清液。

8、沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g×3min，弃上清液。

9、室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100mlTE溶解过夜。

、 全血的采集保存和DNA的提取

I. 用 含抗凝剂的采血管进行采血，抗凝剂一般有EDTA和肝素，EDTA更好一些，不会影响下游的反应，如果没有采血管，也可以自己添加抗凝剂EDTA，提前准 备0.04M的EDTA溶液，每5ml的血液中加入0.4ml配好的EDTA溶液，颠倒混匀即可。保存于-20℃至-80℃，一般2-3年内均可以提取，保存时间越短，提取的质量越高，最好在2个月内提取。

II. DNA提取方法的选择：全血提取试剂盒一般有离心柱和溶液型两种（比如Qiagen、 Promega、Bioteke；摒弃酚氯仿手提的方法，时间长毒性大），原理及步骤基本相同。虽然各公司推出了N多型号，让人不知如何去选择，但从原理 和操作步骤看，基本就是离心柱和溶液型两种。一般来说，离心柱（DP1801）的提取纯度高一些，但是处理量小（0.1-1ml）、得率略低；溶液型 （DP2101或DP2201）的提取量大（1-10ml）得率也高于离心柱。医院的血液标本一般在2ml以上，一般选择溶液型的方法提取.在说到国产和 进口差别的时候，很多人以为进口一定比国产的好，我们觉得没有最好，只有更好！在不断的进行试验优化之后，全血基因组DNA提取试剂盒DP2101或 DP2201开创了第三代技术，不需要蛋白酶K消化，进口的都是要借助蛋白酶K的啊！DP2101或DP2201减少了蛋白酶K现配现用的麻烦和消化的时 间，而且提取量和稳定性更好。

III. 非抗凝血（凝固血）能否提取？答案是肯定的，而且一点都不麻烦，提取效果和抗凝血没有差别！在你找遍了进口的所有品牌都找不到后，回过头来您才发现原来他就在身边，百泰克的凝固血基因组DNA提取试剂盒已经有很多忠实的用户。

下在是网上找的一般保存DNA的方法 DNA在如下情况下稳定： （1）中性pH，

（2）低温，可以储存于-20度冰箱， （3）暗处（避免紫外线），

（4）合适的盐浓度（比如100mmol/LNaCl）， （5）无物理剪切。

在DNA操作中应该降低DNase对于DNA的降解，大部分DNase降解DNA时要有二价阳离子（如Mg2+，Ca2+），可以加入EDTA进DNA溶液。还有要避免来自细菌和土壤溶液的污染物，其中很可能有DNase。 有三种缓冲溶液可用于溶解或保存DNA:

(1)TE[T10E1:10mmol/L Tris.HCl(pH=8.0),1mmol/LEDTA(pH=8.0)]； (2)0.1*TE(用于酶促反应）；

(3)T50E[T50E:50mmol/L Tris.HCl(pH=8.0),1mmol/LEDTA(pH=8.0)。用于溶解

pH不稳定的DNA]。

降解的问题跑胶就很容易判断了，保存的TE或者ddH2O都要灭菌的，不然冻-20还是容易降解。